腺病毒介导的人GM-CSF基因转染瘤苗增强机体免疫功能的实验研究
作者：刘庆宏 钱海鑫 甘健和 许期年 陈易人
单位：刘庆宏(扬州大学医学院附属苏北医院肿瘤外科 扬州 225001)；钱海鑫 甘健和 许期年 陈易人(苏州医学院附属第一医院)
关键词：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；腺病毒；疫苗；基因疗法
肿瘤000410 摘要：目的 研究腺病毒介导的人GM-CSF基因转染瘤苗体内抗肿瘤 免疫作用极其机理。方法 应用GM-CSF基因转染、辐照的瘤苗对 小鼠肝癌模型进行免疫基因治疗，观察该疗法对荷瘤小鼠脾细胞NK、LAK、CTL活性的影响、 脾淋巴细胞转化反应的影响以及荷瘤小鼠的生存期。结果 经GM-CSF基因 转染瘤苗治疗后，脾细胞CTL活性显著升高，而NK、LAK细胞活性未见明显增强、脾淋巴细胞 转化反应显著增强、生存期显著延长。结论 GM-CSF基因转染瘤苗能诱导出有效的抗肿瘤免疫反应，揭示了应用该疗法进行肿瘤 基因治疗的可行性。
, 百拇医药
中图分类号：R730.3 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04- 0266-03
AUGMENT OF ANTO-TUMOR IMMUNITY IN VIVO WITH ADENOVIRUS-MEDIATED HUMAN GM-CSF GENE THERAPY
LIU Qing-hong
(Department of Carcinoma Surger y, Subei Hospital, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001,China)
QIAN Hai-xin
(Department of Carcinoma Surger y, Subei Hospital, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001,China)
, 百拇医药
GAN Jian-he,et al.
(Department of Carcinoma Surger y, Subei Hospital, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001,China)
Abstract：Objective To study the antitumor effect of cancer vaccine transfected with human GM-CSF gene in vivo and its mechanism. Methods The NK, LAK, CTL act ivity and the lymphocyte transformation test (LTT) of splenocytes from tumor-be aring mice after treated with GM-CSF-transfected and irradiated cancer cells w ere measured. The survival time was also observed. Results Treated with GM-CSF-transfected and irradiated cancer cells not only significantly augmented LTT and CTL activity (but not NK or LAK activity) of splenocytes, and also significantly prolonged the survival time of tumor-bearing mice. Conclusion Irradiated an d GM-CSF-transfected tumor cells induced effective anti-tumor immunity. The e xpression of GM-CSF gene in tumor cells seems to be feasible for cancer gene th erapy.
, 百拇医药
Key words： GM-CSF; Adenovirus; Vaccines; Gene therapy
重组腺病毒载体能成功地介导GM-CSF基因转染H22细胞并能有效表达、GM-CSF基因 转染瘤苗体内致瘤性显著降低[1]。本文进一步研究该疗法体内应用后对荷瘤小鼠 免疫功能的影响，以期为该疗法应用于临床肿瘤治疗提供理论依据。
材料与方法
1、主要试剂 携带人GM-CSF基因的重组腺病毒载体(Ad5亚型)以及未携带人GM-CSF基因 的假腺病毒颗粒由美国贝勒医学院黄汉贤博士研制并提供。3H-TDR购于上海原子能 研究所。基因重组人IL-2购于上海生物化学研究所。PHA购于广州医学工业研究所。RPMI- 1640购自日本制药株式会社。胰酶及DNA酶为Difco公司产品。
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2、动物及细胞株 BALB/c近交系小鼠，雄性，6～8周龄，16～18 g，购自中科院上海实验 动物中心。小鼠肝癌细胞株(H22)购自中科院上海药物研究所。K562、P81 5细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所。
3、GM-CSF基因转染瘤苗的获得 参照文献[1]，命名为H22-GM+。同法 获得未携带人GM-CSF基因的假腺病毒颗粒的肝癌细胞，命名为H22-GM-。
4、瘤苗的辐照处理 见参考文献[1]。
5、小鼠脾淋巴细胞悬液的制备 参照文献[2]，用RPMI-1640配成2×106/ml， 等用。
, 百拇医药
6、小鼠脾细胞LAK、CTL活性的诱导 取脾淋巴细胞悬液置于含10 % FCS的培养液中，加入r IL-2至终浓度为1000 μ/ml，培养3天，检测LAK活性。将脾淋巴细胞悬液与辐照灭活的H 22细胞以20∶1比例置于含10 % FCS的培养液中，置于5 % CO2、37℃温箱中温育6 天后检测CTL杀伤活性。
7、NK、LAK、CTL活性的检测 均采用3H-TDR掺入法。检测NK选用K562为靶细 胞，检测LAK时选用P815为靶细胞，检测CTL时选用野生型H22为靶细胞。用γ 计数仪测定cpm值。
8、小鼠脾淋巴细胞转化实验 采用3H-TDR掺入法。用γ计数仪测定cpm值，结果以 刺激指数(SI)表示：
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9、荷瘤小鼠的制备及治疗观察 取体内传代H22肝癌细胞第5～7天的BALB/c小鼠，抽 取癌性腹水，用Hanks液洗2遍，配成1×106/ml，给BALB/c小鼠皮下接种0.1 ml，当皮下 长 出肿瘤结节达2 mm时随机分为4组，每组10只，进行体内实验，下述治疗每周1次，连续2周 ， 其中5只用于免疫学指标的检测，于荷瘤后第15天处死小鼠送检，5只用于观察生存期。分组 如下：A组：对照组，腹腔内注射Hanks液0.1 ml/次，每天3次，连续3天；B组：H22 瘤苗治疗组，腹腔内注射1×108/ml用野生型H22细胞制成的瘤苗0.1 ml。C组：H 22-GM-瘤苗治疗组，腹腔内注射1×108/ml H22-GM-瘤苗0.1 ml。 D组：H22-GM+瘤苗治疗组，腹腔内注射1×108/ml H22-GM+瘤苗0. 1 ml。
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10、统计学分析 采用两样本均数比较的t检验、方差齐性检验。
结果
1、对荷瘤小鼠脾细胞NK、LAK、CTL活性的影响 H22-GM+瘤苗应用后对荷瘤小鼠 脾细 胞NK、LAK活性影响不大，各组间无显著差异(P>0.05)，对于CTL活性的影响比较明显 。B、C组与对照组间差异不明显(P>0.05)，而D组与对照组间存在显著差异(P<0 .005)。表明H22-GM+瘤苗应用后使CTL活性显著升高(见表1)。
表1 荷瘤小鼠经不同治疗脾细胞NK、LAK、CTL杀伤活性 分组
(n=5)
杀伤活性(%)(
±s)
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NK
LAK
CTL
A(Hanks)
18.68±2.68
16.76±3.07
26.09±3.08
B(野生型H22)
20.64±3.42
17.92±3.71
28.10±3.00
C(H22-GM-)
, 百拇医药
16.94±1.45
17.62±3.97
26.76±2.77
D(H22-GM+)
14.65±2.33
15.88±3.52
46.54±5.51*
注：与Hanks对照组相比*P<0.005
2、对小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响 不同治疗对荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响不 同，与Hanks液对照组相比，野生型H22瘤苗和H22-GM-瘤苗对荷瘤小鼠脾 淋巴 细胞转化反应无明显增强作用(P>0.05)，而H22-GM+瘤苗应用后则可使脾 淋巴 细胞转化反应显著升高(P<0.01)，提示H22-GM+瘤苗应用后，机体细胞免 疫功能有所增强(见表2)。
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表2 不同治疗对荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响 分组(n=5)
淋巴细胞转化反应(%)(±s)
A(Hanks)
35.87±5.02
B(野生型H22)
37.20±6.33
C(H22-GM-)
37.43±4.35
, 百拇医药
D(H22-GM+)
63.46±9.52*
注：与Hanks对照组相比*P<0.01
3、对荷瘤小鼠存活期的影响 本实验以皮下接种H22肝癌细胞为荷瘤模型，观察了各 种不同治疗对荷瘤小鼠存活期的影响，结果：A组(Hanks)：23.0±2.25；B组(野生型H 22)：26.6±2.25；C组(H22-GM-)：24.8±2.71；D组(H22-GM +)：52.2±6.61，统计学处理：B、C组与对照组相比无显著差异(P>0.05)，而D组 与对照组差异非常显著(P<0.005)。以上说明：H22-GM+瘤苗体内应用后发 挥了一定的抗肿瘤效应，使荷瘤小鼠存活期明显延长。
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讨论
细胞因子基因疗法是目前肿瘤基因治疗研究中的热门课题。人们设法将具有免疫调节作用和 抗肿瘤作用的细胞因子基因导入宿主体内，并使之稳定有效地表达，使其体内持续存在一定 水平的内源性细胞因子，已取了初步疗效，它比直接注射细胞因子治疗的毒副作用轻、疗效 佳。
GM-CSF作为一种具有多种潜能的造血生长因子，目前正被用于恶性肿瘤的临床和实验研究 。Dranoff[3]等实验证实：分泌GM-CSF的黑色素瘤细胞在体内激发的强烈、长期 、特异的抗肿瘤免疫效应需CD4+、CD8+ T细胞参与。Armstrong[4]将分 泌GM-CSF的黑素瘤细胞接种小鼠皮下，局部组织切片示大量的CD4+、CD8+T细胞 的浸润。章卫平等[5]应用GM-CSF基因工程瘤苗免疫治疗小鼠，免疫功能检测发现 脾脏CTL活性显著升高。作者在以前的研究中证实：GM-CSF基因转染瘤苗体内致瘤性降低 、瘤苗的辐照处理抑制了肿瘤细胞的增生，但并不影响细胞因子的表达[1]，在此 基础上进一步研究了其对机体免疫功能的影响。本实验观察到：GM-CSF基因转染H22 细胞在体内对于NK、LAK细胞活性的影响与对照组相比无显著差异，说明该疗法对机体NK、L AK细胞活性没有增强作用，而与对照组相比CTL杀伤活性明显升高，这可能是GM-CSF基因 转染瘤苗应用后发挥了一定抗肿瘤效应，使荷瘤小鼠存活期明显延长的最主要原因。由于野 生型H22瘤苗和H22-GM-瘤苗组CTL杀伤活性未见明显升高，因此CTL杀伤活 性 升高与GM-CSF基因导入及表达分泌有关。而脾淋巴细胞转化反应显著升高则进一步表明， 该疗法使机体细胞免疫功能明显增强。
, 百拇医药
研究表明，GM-CSF基因转染瘤苗体内接种后，局部持续存在的GM-CSF，一方面通过一 系列机制使其致瘤性降低、免疫原性增强，为激活免疫功能打下基础；另一方面，则招引多 种免疫效应细胞(主要是CTL细胞)大量浸润，并激活其功能，对肿瘤细胞进行排斥和杀伤。 GM-CSF基因转染瘤苗这一抗肿瘤机制的发现，为进一步深入研究奠定了基础，也为最终 将其运用于临床治疗恶性肿瘤提供了理论和实验依据。
作者简介：刘庆宏，男，硕士，主治医师。
参考文献
[1]钱海鑫，刘庆宏，甘建和，等. 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因转染 瘤苗的抗肿瘤研究〔J〕. 中华实验外科杂志，1998，15(2)：141
[2]Awwar M, North KJ. Cyclophosphamide-induced immunologically mediated of a cyclosphamide-resistent murine tumor: A consequence of eliminating precursor L 3T4+ suppressor T-sells〔J〕. Res, 1989, 49:1649
, 百拇医药
[3]Dranoff G, Jaffee F, Lazenby A, et al. Vaccination with irradiated tumor ce lls engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating fac tor stimulate potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity〔J〕. Pro c Natl Acad Sci USA, 1993, 90:3539
[4]Armstrong CA, Bottella TH, Murrag N, et al. Antitumor effects of granulocyt e-macrophage colony-stimulating factor production by melanoma cells〔J〕. Canc er Res, 1996, 56(9):2191
[5]章卫平，曹雪涛，黄欣，等. GM-CSF基因修饰的不同肿瘤瘤苗体内诱导抗肿瘤免疫功 能的比较〔J〕. 中国肿瘤生物治疗杂志，1995，2(4)：321
(收稿日期：1998-11-12；修回日期：1999-01-25), 百拇医药
单位：刘庆宏(扬州大学医学院附属苏北医院肿瘤外科 扬州 225001)；钱海鑫 甘健和 许期年 陈易人(苏州医学院附属第一医院)
关键词：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；腺病毒；疫苗；基因疗法
肿瘤000410 摘要：目的 研究腺病毒介导的人GM-CSF基因转染瘤苗体内抗肿瘤 免疫作用极其机理。方法 应用GM-CSF基因转染、辐照的瘤苗对 小鼠肝癌模型进行免疫基因治疗，观察该疗法对荷瘤小鼠脾细胞NK、LAK、CTL活性的影响、 脾淋巴细胞转化反应的影响以及荷瘤小鼠的生存期。结果 经GM-CSF基因 转染瘤苗治疗后，脾细胞CTL活性显著升高，而NK、LAK细胞活性未见明显增强、脾淋巴细胞 转化反应显著增强、生存期显著延长。结论 GM-CSF基因转染瘤苗能诱导出有效的抗肿瘤免疫反应，揭示了应用该疗法进行肿瘤 基因治疗的可行性。
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中图分类号：R730.3 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04- 0266-03
AUGMENT OF ANTO-TUMOR IMMUNITY IN VIVO WITH ADENOVIRUS-MEDIATED HUMAN GM-CSF GENE THERAPY
LIU Qing-hong
(Department of Carcinoma Surger y, Subei Hospital, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001,China)
QIAN Hai-xin
(Department of Carcinoma Surger y, Subei Hospital, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001,China)
, 百拇医药
GAN Jian-he,et al.
(Department of Carcinoma Surger y, Subei Hospital, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001,China)
Abstract：Objective To study the antitumor effect of cancer vaccine transfected with human GM-CSF gene in vivo and its mechanism. Methods The NK, LAK, CTL act ivity and the lymphocyte transformation test (LTT) of splenocytes from tumor-be aring mice after treated with GM-CSF-transfected and irradiated cancer cells w ere measured. The survival time was also observed. Results Treated with GM-CSF-transfected and irradiated cancer cells not only significantly augmented LTT and CTL activity (but not NK or LAK activity) of splenocytes, and also significantly prolonged the survival time of tumor-bearing mice. Conclusion Irradiated an d GM-CSF-transfected tumor cells induced effective anti-tumor immunity. The e xpression of GM-CSF gene in tumor cells seems to be feasible for cancer gene th erapy.
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Key words： GM-CSF; Adenovirus; Vaccines; Gene therapy
重组腺病毒载体能成功地介导GM-CSF基因转染H22细胞并能有效表达、GM-CSF基因 转染瘤苗体内致瘤性显著降低[1]。本文进一步研究该疗法体内应用后对荷瘤小鼠 免疫功能的影响，以期为该疗法应用于临床肿瘤治疗提供理论依据。
材料与方法
1、主要试剂 携带人GM-CSF基因的重组腺病毒载体(Ad5亚型)以及未携带人GM-CSF基因 的假腺病毒颗粒由美国贝勒医学院黄汉贤博士研制并提供。3H-TDR购于上海原子能 研究所。基因重组人IL-2购于上海生物化学研究所。PHA购于广州医学工业研究所。RPMI- 1640购自日本制药株式会社。胰酶及DNA酶为Difco公司产品。
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2、动物及细胞株 BALB/c近交系小鼠，雄性，6～8周龄，16～18 g，购自中科院上海实验 动物中心。小鼠肝癌细胞株(H22)购自中科院上海药物研究所。K562、P81 5细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所。
3、GM-CSF基因转染瘤苗的获得 参照文献[1]，命名为H22-GM+。同法 获得未携带人GM-CSF基因的假腺病毒颗粒的肝癌细胞，命名为H22-GM-。
4、瘤苗的辐照处理 见参考文献[1]。
5、小鼠脾淋巴细胞悬液的制备 参照文献[2]，用RPMI-1640配成2×106/ml， 等用。
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6、小鼠脾细胞LAK、CTL活性的诱导 取脾淋巴细胞悬液置于含10 % FCS的培养液中，加入r IL-2至终浓度为1000 μ/ml，培养3天，检测LAK活性。将脾淋巴细胞悬液与辐照灭活的H 22细胞以20∶1比例置于含10 % FCS的培养液中，置于5 % CO2、37℃温箱中温育6 天后检测CTL杀伤活性。
7、NK、LAK、CTL活性的检测 均采用3H-TDR掺入法。检测NK选用K562为靶细 胞，检测LAK时选用P815为靶细胞，检测CTL时选用野生型H22为靶细胞。用γ 计数仪测定cpm值。
8、小鼠脾淋巴细胞转化实验 采用3H-TDR掺入法。用γ计数仪测定cpm值，结果以 刺激指数(SI)表示：
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9、荷瘤小鼠的制备及治疗观察 取体内传代H22肝癌细胞第5～7天的BALB/c小鼠，抽 取癌性腹水，用Hanks液洗2遍，配成1×106/ml，给BALB/c小鼠皮下接种0.1 ml，当皮下 长 出肿瘤结节达2 mm时随机分为4组，每组10只，进行体内实验，下述治疗每周1次，连续2周 ， 其中5只用于免疫学指标的检测，于荷瘤后第15天处死小鼠送检，5只用于观察生存期。分组 如下：A组：对照组，腹腔内注射Hanks液0.1 ml/次，每天3次，连续3天；B组：H22 瘤苗治疗组，腹腔内注射1×108/ml用野生型H22细胞制成的瘤苗0.1 ml。C组：H 22-GM-瘤苗治疗组，腹腔内注射1×108/ml H22-GM-瘤苗0.1 ml。 D组：H22-GM+瘤苗治疗组，腹腔内注射1×108/ml H22-GM+瘤苗0. 1 ml。
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10、统计学分析 采用两样本均数比较的t检验、方差齐性检验。
结果
1、对荷瘤小鼠脾细胞NK、LAK、CTL活性的影响 H22-GM+瘤苗应用后对荷瘤小鼠 脾细 胞NK、LAK活性影响不大，各组间无显著差异(P>0.05)，对于CTL活性的影响比较明显 。B、C组与对照组间差异不明显(P>0.05)，而D组与对照组间存在显著差异(P<0 .005)。表明H22-GM+瘤苗应用后使CTL活性显著升高(见表1)。
表1 荷瘤小鼠经不同治疗脾细胞NK、LAK、CTL杀伤活性 分组
(n=5)
杀伤活性(%)(
±s), http://www.100md.com
NK
LAK
CTL
A(Hanks)
18.68±2.68
16.76±3.07
26.09±3.08
B(野生型H22)
20.64±3.42
17.92±3.71
28.10±3.00
C(H22-GM-)
, 百拇医药
16.94±1.45
17.62±3.97
26.76±2.77
D(H22-GM+)
14.65±2.33
15.88±3.52
46.54±5.51*
注：与Hanks对照组相比*P<0.005
2、对小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响 不同治疗对荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响不 同，与Hanks液对照组相比，野生型H22瘤苗和H22-GM-瘤苗对荷瘤小鼠脾 淋巴 细胞转化反应无明显增强作用(P>0.05)，而H22-GM+瘤苗应用后则可使脾 淋巴 细胞转化反应显著升高(P<0.01)，提示H22-GM+瘤苗应用后，机体细胞免 疫功能有所增强(见表2)。
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表2 不同治疗对荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响 分组(n=5)
淋巴细胞转化反应(%)(
±s)A(Hanks)
35.87±5.02
B(野生型H22)
37.20±6.33
C(H22-GM-)
37.43±4.35
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D(H22-GM+)
63.46±9.52*
注：与Hanks对照组相比*P<0.01
3、对荷瘤小鼠存活期的影响 本实验以皮下接种H22肝癌细胞为荷瘤模型，观察了各 种不同治疗对荷瘤小鼠存活期的影响，结果：A组(Hanks)：23.0±2.25；B组(野生型H 22)：26.6±2.25；C组(H22-GM-)：24.8±2.71；D组(H22-GM +)：52.2±6.61，统计学处理：B、C组与对照组相比无显著差异(P>0.05)，而D组 与对照组差异非常显著(P<0.005)。以上说明：H22-GM+瘤苗体内应用后发 挥了一定的抗肿瘤效应，使荷瘤小鼠存活期明显延长。
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讨论
细胞因子基因疗法是目前肿瘤基因治疗研究中的热门课题。人们设法将具有免疫调节作用和 抗肿瘤作用的细胞因子基因导入宿主体内，并使之稳定有效地表达，使其体内持续存在一定 水平的内源性细胞因子，已取了初步疗效，它比直接注射细胞因子治疗的毒副作用轻、疗效 佳。
GM-CSF作为一种具有多种潜能的造血生长因子，目前正被用于恶性肿瘤的临床和实验研究 。Dranoff[3]等实验证实：分泌GM-CSF的黑色素瘤细胞在体内激发的强烈、长期 、特异的抗肿瘤免疫效应需CD4+、CD8+ T细胞参与。Armstrong[4]将分 泌GM-CSF的黑素瘤细胞接种小鼠皮下，局部组织切片示大量的CD4+、CD8+T细胞 的浸润。章卫平等[5]应用GM-CSF基因工程瘤苗免疫治疗小鼠，免疫功能检测发现 脾脏CTL活性显著升高。作者在以前的研究中证实：GM-CSF基因转染瘤苗体内致瘤性降低 、瘤苗的辐照处理抑制了肿瘤细胞的增生，但并不影响细胞因子的表达[1]，在此 基础上进一步研究了其对机体免疫功能的影响。本实验观察到：GM-CSF基因转染H22 细胞在体内对于NK、LAK细胞活性的影响与对照组相比无显著差异，说明该疗法对机体NK、L AK细胞活性没有增强作用，而与对照组相比CTL杀伤活性明显升高，这可能是GM-CSF基因 转染瘤苗应用后发挥了一定抗肿瘤效应，使荷瘤小鼠存活期明显延长的最主要原因。由于野 生型H22瘤苗和H22-GM-瘤苗组CTL杀伤活性未见明显升高，因此CTL杀伤活 性 升高与GM-CSF基因导入及表达分泌有关。而脾淋巴细胞转化反应显著升高则进一步表明， 该疗法使机体细胞免疫功能明显增强。
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研究表明，GM-CSF基因转染瘤苗体内接种后，局部持续存在的GM-CSF，一方面通过一 系列机制使其致瘤性降低、免疫原性增强，为激活免疫功能打下基础；另一方面，则招引多 种免疫效应细胞(主要是CTL细胞)大量浸润，并激活其功能，对肿瘤细胞进行排斥和杀伤。 GM-CSF基因转染瘤苗这一抗肿瘤机制的发现，为进一步深入研究奠定了基础，也为最终 将其运用于临床治疗恶性肿瘤提供了理论和实验依据。
作者简介：刘庆宏，男，硕士，主治医师。
参考文献
[1]钱海鑫，刘庆宏，甘建和，等. 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因转染 瘤苗的抗肿瘤研究〔J〕. 中华实验外科杂志，1998，15(2)：141
[2]Awwar M, North KJ. Cyclophosphamide-induced immunologically mediated of a cyclosphamide-resistent murine tumor: A consequence of eliminating precursor L 3T4+ suppressor T-sells〔J〕. Res, 1989, 49:1649
, 百拇医药
[3]Dranoff G, Jaffee F, Lazenby A, et al. Vaccination with irradiated tumor ce lls engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating fac tor stimulate potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity〔J〕. Pro c Natl Acad Sci USA, 1993, 90:3539
[4]Armstrong CA, Bottella TH, Murrag N, et al. Antitumor effects of granulocyt e-macrophage colony-stimulating factor production by melanoma cells〔J〕. Canc er Res, 1996, 56(9):2191
[5]章卫平，曹雪涛，黄欣，等. GM-CSF基因修饰的不同肿瘤瘤苗体内诱导抗肿瘤免疫功 能的比较〔J〕. 中国肿瘤生物治疗杂志，1995，2(4)：321
(收稿日期：1998-11-12；修回日期：1999-01-25), 百拇医药